儲存條件：2-8℃避光保存，有效期1年。

試劑盒說明：

多重?zé)晒饷庖呓M化（TSA技術(shù)）基于酪胺信號放大（TSA）技術(shù)，利用抗原抗體反應(yīng)對樣本中多種蛋白標(biāo)志物進(jìn)行染色標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)在同一組織切片上多個(gè)靶標(biāo)蛋白共同染色。

酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶（HRP）對靶蛋白進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法。熒光標(biāo)記的酪胺分子在H₂O₂環(huán)境下被二抗標(biāo)記的HRP催化激活，產(chǎn)生大量的酶促反應(yīng)，使熒光素在抗原-抗體結(jié)合部位與組織周圍的蛋白殘基 (包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，形成大量的熒光素沉積，實(shí)現(xiàn)信號放大，利用熱處理或微波處理可洗脫一抗和二抗并同時(shí)保留與組織抗原共價(jià)結(jié)合的熒光素，通過使用不同的偶聯(lián)染料多次循環(huán)實(shí)驗(yàn)對多種蛋白抗原進(jìn)行熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)一張組織切片上多個(gè)蛋白的共染色。

此試劑盒中的熒光染料可單獨(dú)或協(xié)作使用，可以實(shí)現(xiàn)1-5標(biāo)染色，染料匹配發(fā)射波長為：480、520、570、620、690。采購或使用前請先確認(rèn)熒光成像設(shè)備通道匹配，本司也可提供相應(yīng)掃描成像服務(wù)。

試劑盒以外自備試劑

二甲苯、乙醇、蒸餾水或去離子水、一抗、熒光成像設(shè)備等。

試劑A和B均為濃縮液，使用時(shí)需按照表格中的稀釋倍數(shù)用蒸餾水或去離子水配制為1X工作液。

預(yù)期用途

主要用于組織石蠟切片樣本的多色免疫熒光染色，同時(shí)兼容冰凍組織切片，建議用戶根據(jù)樣本類型優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。

染色方法及操作步驟（石蠟切片為例）：

Step 1: 玻片準(zhǔn)備

1、脫蠟：脫蠟前應(yīng)將組織玻片在烤片機(jī)上60℃烘烤1-2hr，后用二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）（Ⅲ）浸泡，各10min

2、水化：無水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）5min，下行至95%、80%、70%酒精（Ⅰ）（Ⅱ）各5min

3、1×PBST沖洗3次，3min/次

Step 2: 微波處理

1. 修復(fù)液提前加熱至98-100℃，將脫蠟后的玻片置于修復(fù)液中煮沸（根據(jù)具體情況選擇修復(fù)液種類，15-20min）

2. 自然冷卻20min以上，冷卻至室溫

3. 1×PBST洗滌3次，3min/次

Step 3: 封閉

1. 擦干組織周圍的水分，用免疫組化筆畫阻水圈

2. 內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（試劑C）孵育10-15min(可選步驟)

3. 1×PBST洗滌3次，3min/次

4. 滴加血清封閉液（試劑D）（100ul/張），置于濕盒室溫封閉10-30min

Step 4: 一抗孵育

1. 去除封閉液

2. 滴加一抗工作液（100ul/張），4℃過夜或37℃孵育1hr（孵育條件根據(jù)抗體說明書推薦條件進(jìn)行調(diào)整）

3. 1×PBST震蕩洗滌3次，3min/次

Step 5: HRP 標(biāo)記二抗孵育

1. 滴加即用型二抗（試劑F），室溫孵育30min左右

注：若一抗是兔抗，則滴加試劑(F)中R液，室溫孵育30min，若一抗是小鼠抗體，則先滴加試劑(F)中M液，室溫孵育15min，隨后PBST洗3次，3min/次，再滴加試劑(F)中R液，室溫孵育15min

2. 1×PBST洗滌3次，3min/次

Step 6:信號放大（滴加 TSA 試劑）

1. 在玻片上滴加即用型熒光染料（試劑G）（100ul/張），室溫孵育10min

2. 1×PBST震蕩洗滌3次，3min/次

Step 7: 微波處理（去除前一輪一抗和二抗）

1. 玻片放入預(yù)熱至98-100℃的修復(fù)液中煮沸（約3min，根據(jù)具體情況選擇修復(fù)液種類），隨后轉(zhuǎn)至中/低火加熱15min（中間注意補(bǔ)液，防止玻片干燥）

2. 自然冷卻20min以上，冷卻至室溫

3. 蒸餾水洗滌3min

4. 1×PBST震蕩洗滌3次，3min/次

5. 重新從步驟Step 3開始實(shí)驗(yàn)到Step 7直到所有的抗體都孵育完成

Step 8: DAPI封片

玻片上滴加含DAPI抗熒光淬滅封片劑（試劑H）封片備用

成像：

切片置于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像等成像設(shè)備下觀察并采集圖像。

染色結(jié)果：

陽性表達(dá)：在理論抗原定位處呈默認(rèn)通道對應(yīng)熒光染色特異性表達(dá)。

注意事項(xiàng)：

1. 如對所染抗體及樣本本身蛋白表達(dá)及組織狀態(tài)不了解，建議先從組化或單標(biāo)測試摸索條件，同時(shí)做陰性對照和陽性對照；

2. 修復(fù)環(huán)節(jié)較多，建議用黏附性較強(qiáng)的玻片制片；

3. 開蓋后應(yīng)盡快使用，保存不當(dāng)易導(dǎo)致試劑效價(jià)降低；

4. 整個(gè)染色過程切忌干片，以免引起染色不均；

5. 多色免疫熒光步驟繁瑣，請?zhí)崆白屑?xì)閱讀說明書及規(guī)劃實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)再繼續(xù)；

6. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并帶一次性手套操作。

檢測設(shè)備